Phân lập alliin từ củ tỏi ở quY mô pilot

Đào Đức Thiện, Nguyễn Thanh Tâm, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trần Đức Quân và Trần Văn Sung

Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam

e-mail: tvs@ich.ncst.ac.vn

(Nhận bài ngày 26 tháng 11 năm 2004)

Summary

Isolation of alliin from Allium sativum L. in pilot scale

S-allylcysteine sulfoxide (alliin), a colourless and odorless solid, existed in intact garlic (Allium sativum L.) cloves. Alliin itself possessed no antibacterial activity, but it quickly converts into allicin, an antibacterial component by the enzyme alliinase, which naturally occurs in garlic. We report in this paper an isolation method for alliin from garlic in pilot scale.

Key words:  Allium sativum L., alliin,  alliinase.

Mở đầu

Tỏi (Allium sativum L.) có vị trí xứng đáng trong y học hiện đại và được công nhận là "cây thuốc của thế kỷ". Từ trước đến nay, ở một mức độ nhất định, tỏi được dùng để chống đầy hơi, bụng chướng, rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, chất chống lại vi sinh vật trong các bệnh nhiễm khuẩn, nấm và virus. Trong những năm gần đây, tỏi được đánh giá cao do nó có tác dụng trong việc làm giảm cholesterol huyết thanh cao, làm hạ huyết áp, chống ung thư, tiểu đường... [1].

Năm 1947, Stoll và Seebeck [2] đã phân lập được một amino acid chứa lưu huỳnh từ tỏi và đặt tên là alliin. Bản thân alliin không có hoạt tính kháng khuẩn và tương đối bền. Vì alliin có hai nguyên tử bất đối nên có thể có 4 đồng phân  quang học, nhưng trong tỏi chỉ thấy có một đồng phân (+)-S-allyl-L-cystein sulfoxid. Alliin là hợp chất đầu tiên được tìm thấy trong thiên nhiên chứa một nguyên tử lưu huỳnh và một nguyên tử carbon bất đối. Alliin  có hàm lượng từ 5 đến 14mg trong một gam tỏi tươi. Do  có nhóm amin, carboxyl, liên kết đôi, nên alliin có khả năng phản ứng hóa học rất cao. Trong các điều kiện phản ứng khác nhau, alliin dễ dàng bị chuyển hoá để tạo ra các sản phẩm. Một trong những phản ứng chuyển hoá cơ bản và quan trọng nhất là sự tạo thành allicin dưới tác dụng của enzym  alliinase [3]. Sự chuyển hoá này xảy ra cực kỳ nhanh ở nhiệt độ phòng chỉ trong vòng 10 giây. Alliinase có mặt trong tỏi với lượng lớn khác thường đối với một enzym, gồm ít nhất 10% tổng protein tép tỏi. Các tép tỏi chứa các lượng alliinase và alliin xấp xỉ bằng nhau (10mg/g trọng lượng tươi). Điều này có thể giải thích rõ tại sao alliin lại chuyển thành các thiosulfid quá nhanh khi tỏi được ép ra [1].

Nhiều quy trình được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tỏi dùng làm thuốc. Các quy trình đó cố gắng giữ lại chất đặc trưng alliin bằng cách tránh sự hoạt hoá của men alliinase. Có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để làm mất hoặc giảm hoạt tính men alliinase như dùng các dung môi chiết xuất [ví dụ methanol/nước (4/1), methanol/acid formic 1% trong nước (1/2)] hoặc dung dịch chứa các chất ức chế alliinase như amino-oxy acetat,... Tuy nhiên, dịch chiết này hoặc bột thu được từ dịch chiết này không chứa alliinase, một tác nhân để phân huỷ alliin thành các hợp chất có hoạt tính. Vì vậy, chế phẩm tỏi này cần được bổ sung một lượng nhất định bột tỏi có chứa allinase đủ để chuyển hoá được hoàn toàn alliin. Ngoài ra, người ta còn sử dụng quy trình ngâm giầm tỏi để chuyển hoá nhanh chóng alliin thành allicin và các hợp chất chứa lưu huỳnh, rồi tiếp tục xử lý bằng hơi nước hoặc các dung môi khác [1].

Vì phân tử alliin có nhiều khả năng phản ứng hóa học, nên hướng nghiên cứu để chuyển hoá nó thành các dẫn xuất có hoạt tính và độ bền cao cũng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm.

Với các giá trị của alliin nêu trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu quy trình phân lập alliin ở quy mô pilot. Bài này nêu các kết quả đã đạt được.

Phần thực nghiệm

Thiết bị và hoá chất:

Các loại phổ sau đây được ghi tại Viện Hóa học:

Phổ hồng ngoại FT-IR, Nicolet IMPACT 410. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon (¹H và ¹³C-NMR), Bruker Avance 500. Bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel Merck 60F₂₅₄ độ dày 0,2mm được sử dụng cho sắc ký lớp mỏng phân tích (SKLMPT). Silica gel Merck 60 cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm được dùng cho sắc ký cột. Nhựa trao đổi cation Amberlit được dùng cho cột trao đổi ion.

Mẫu thực vật và phương pháp chiết tách:

Củ tỏi tươi đã bóc vỏ (200kg) mua tại chợ Nghĩa Tân, Hà Nội, vào tháng 2/2002, được xay nhỏ trong điều kiện bất hoạt men alliinase, vắt lấy nước. Nước tỏi vắt ra để lắng, gạn bỏ cặn tinh bột và chất bẩn để lấy phần nước trong, rồi cho chạy qua cột trao đổi cation. Nhựa trao đổi cation đã được hoạt hóa trước bằng dung dịch acid clohydric 5% trong 4 giờ, rửa bằng nước đến pH = 7. Sau đó, cột được rửa bằng nước cất với 3 lần thể tích cột để loại hỗn hợp đường. Phần amino acid hấp thu trong cột được giải hấp bằng dung dịch NH₄OH / MeOH với tỷ lệ 1 / 3 theo thể tích. Cất loại dung môi dịch giải hấp dưới áp suất giảm thu được 20g cặn. Cặn này được tinh chế bằng cột silica gel, giải hấp bằng hỗn hợp dung môi CHCl₃ : MeOH (6 : 4) thu được 240g alliin sạch (hiệu suất 0,12%).

Kết quả và thảo luận

Alliinase có hoạt tính tối đa ở pH 5-8. Nó sẽ bị phá huỷ nhanh chóng trong điều kiện pH bằng hay nhỏ hơn 3,5; do đó, nó sẽ ngăn cản sự hình thành allicin và các thiosulfid khác. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của men alliinase là 33 - 37⁰C [1]. Từ dịch ép củ tỏi tươi đã được bất hoạt men alliinase, chúng tôi đã phân lập được alliin sạch với hiệu suất là 0,12% so với tỏi tươi. Dịch ép này được loại tinh bột và các chất cặn khác bằng cách lắng gạn. Dịch trong còn lại chứa đường, hỗn hợp amino acid và một số chất phân cực khác. Để tách riêng được hỗn hợp amino acid, chúng tôi đã sử dụng cột trao đổi cation. Hỗn hợp các amino acid hấp thụ ở trên cột được giải hấp bằng dung dịch amoniac và sau đó được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với dung môi giải hấp thích hợp sẽ cho alliin sạch. Alliin phân lập được là tinh thể màu trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon (¹H và ¹³C-NMR) của nó hoàn toàn phù hợp với alliin chuẩn (2) mua của hãng Sigma.

Phổ hồng ngoại (FT-IR) của alliin cho đỉnh hấp thụ tại 1044cm^-1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR) thể hiện tín hiệu của 8 proton, bao gồm một nhóm allyl [d_H 5,95 m (1H), 5,54 m (2H), 3,67 dd (1H, 6,0, 13,8) 3,46 dd (1H, 6,0, 13,8)], một tín hiệu của nhóm methyl gắn với nitơ (-CH-N-) cộng hưởng tại d_H 4,18 dd (1H, 6,0, 7,8) và một nhóm methylen gắn với lưu huỳnh ở d_H 3,22 m (1H) và 3,84 dd (1H, 7,0, 13,3). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (¹³C-NMR) cho tín hiệu của 6 nguyên tử carbon, bao gồm  1 nhóm  carboxyl (d_C 171,5), một nối đôi (CH₂=CH-) ở d_C 125,6 và 126,1, một nhóm  methyl ở d_C 51,2 và hai nhóm methylen cộng hưởng tại d_C 49,9 và 56,1. Các số liệu phổ của chất alliin mà chúng tôi phân lập được và của chất chuẩn được đưa ở bảng 1.