Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng và quang chu kỳ đến hệ

số nhân cây ráy (Alocasia odora c.koch)

Trần Thị Liên, Phạm Văn Hiển

Phòng nuôi cấy mô tế bào - Viện Dược liệu

(Nhận bài ngày 21 tháng 12 năm 2004)

Summary

   Meristems of the rhizome of Alocasia odora C.Koch were induced to develop into plantlets in a medium containing MS - minerals and 3mg/l BAP. Plantlets produced multipl shoots in the basas medium supplemented 3mg/1 BAP and 0,2 mg/l IBA with out Agar. For shoot froliferation from shoot - tip the light regime as adopted 10/24 (light/dark). Rooted plantled were acclimatized and grown in the green house.

Key word: Alocasia odora C. Koch, Invitro propagation, Benzyl amino purrin.

   (Chú thích: BAP: Benzyl amino purin; IBA: Indol butyric acid;

    MS: Musashige Skoog, 1962; CT: Công thức)

1. Mở đầu

Cây ráy (Alocasia odora C.Koch - họ Araceae) thuộc loại thân thảo, sống nhiều năm, mọc hoang ở nhiều nơi, nhất là những chỗ đất ẩm ven rừng. Theo y học cổ truyền, ráy có tính lạnh, ngứa và độc. Kinh nghiệm nhân dân thường dùng củ ráy xát vào chỗ bị ngứa do chạm phải lá han; nấu nước tắm hoặc chế cao chữa mề đay, lở ngứa, mụn nhọt, vết thương. Lá ráy được dùng chữa sốt cao. ở Campuchia, người ta cũng dùng củ ráy để chữa ghẻ ngứa. ở Trung Quốc, ráy là thuốc chữa sốt rét, thũng độc, lở ngứa... [1] [4 ].

Những năm gần đây, một số nghiên cứu đã phát hiện tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và tác động chống gốc tự do của flavonoid chiết từ "củ" ráy [ 3 ]. Đã thử nghiệm tác dụng của flavonoid này đối với vết loét mạn tính ở những bệnh nhân phong thấy có tác dụng tích cực [3]. Điều này làm cho cây ráy trở thành loại dược liệu đáng được chú ý. Một số cơ sở khoa học trong nước và nước ngoài đang tập trung nghiên cứu thành phần hoá học cũng như công dụng của cây này [3], [5], [6].

Để góp phần nắm vững một số đặc điểm sinh học phục vụ cho nhu cầu phát triển trồng, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro cây ráy, với mục đích chủ động tạo ra một khối lượng lớn cây giống đồng nhất về chất lượng cho sản xuất (khi cần thiết).

2. Nguyên liệu và phương pháp

Chồi ráy được lấy từ các cây ráy trồng, lưu giữ tại vườn cây thuốc của trung tâm nghiên cứu cây thuốc của Viện dược liệu - Hà Nội.

Các mẫu này được rửa sạch bằng nước xà phòng loãng ngâm thuốc diệt nấm và khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút, tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường dinh dưỡng Murashige và Skoog (MS) có cải tiến.

Các chất điều hoà sinh trưởng được bổ sung vào môi trường cơ bản với các tổ hợp và nồng độ khác nhau.

Mỗi công thức thí nghiệm được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần quan sát ít nhất 12 mẫu.

Phòng nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25 - 27⁰C, độ ẩm £ 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux với chu kỳ chiếu sáng 14h/ngày. Số liệu được xử lý theo Microsoft excel (Anova).

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Tạo vật liệu khởi đầu

vật liệu nghiên cứu là các chồi đỉnh của cây  ráy. Trước khi đưa vào nuôi cấy, mẫu được xử lý khử trùng bằng HgCl₂ với các nồng độ và thời gian khác nhau.

khử trùng chồi ráy bằng dung dịch HgCl₂ nồng độ 0,1% trong thời gian xử lý 15 phút đạt tỷ lệ sống cao nhất (62,1%). Sau đến nồng độ 0,07%, trong thời gian 17 phút (56,6%); tỷ lệ sống thấp nhất ở nồng độ 0,07%, trong thời gian 10 phút (25,8%) (bảng 1).

Bảng1: ảnh hưởng của thời gian và nồng độ HgCl₂ đến mẫu ráy.

3.2. Tái sinh chồi

Mẫu chồi sau khi đã khử trùng, được đưa vào nuôi cấy, nghiên cứu khả năng tái sinh chồi trên các dải nồng độ BAP khác nhau (bảng 2).

Bảng 2 cho thấy BAP có tác dụng kích thích mạnh đến qúa trình tái sinh chồi sơ cấp ở cây ráy. Chỉ cần  bổ sung  1mg/l  BAP  vào môi trường,  số

chồi trên mẫu đã tăng gấp 3 lần (môi trường CT2 so với CT1). Khi nồng độ BAP tăng 3mg/l, số chồi/mẫu tăng, số rễ/mẫu cũng tăng nhưng chiều cao lại giảm dần và sự biến động của số lá/chồi không thể hiện rõ quy luật.

Môi  trường  thích  hợp  nhất  ở  giai  đoạn này là MS + 3mg/1 BAP đạt trung bình 3,92  chồi/ mẫu.

Bảng 2: ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tái sinh chồi cây ráy.

3.3. Giai đoạn nhân nhanh

3.3.1. Giai đoạn nhân nhanh trên nền môi trường đặc

Chồi được lấy từ cây in vitro cấy vào môi trường có bổ sung BAP và IAB ở các nồng độ khác nhau.

Các kết quả nghiên cứu cho thấy IBA cải thiện đáng kể số lượng chồi hình thành. ở môi trường chứa 0,2mg/1 IBA (CT2) số chồi/mẫu đạt cao nhất (3,7 chồi) xấp xỉ giai đoạn khởi động. Các chỉ tiêu sinh trưởng khác của cây cũng tăng khi môi trường nuôi cấy bổ sung thêm IBA (bảng 3).

Bảng 3: ảnh hưởng của tổ hợp BAT + IAB lên phát sinh hình thái

3.3.2. Giai đoạn nhân nhanh trên nền môi trường lỏng

Dùng những chồi ráy in vitro loại bỏ hết phần cuống lá nuôi trong môi trường lỏng, lắc với tốc độ

60 vòng / phút ở điều kiện bình thường trong phòng nuôi (25 ± 2⁰C, 14 giờ sáng / 10 giờ tối). Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 4.

Bảng 4 cho thấy ở nồng độ 1mg/1 BAP, cây sinh trưởng trên nền môi trường lỏng tốt hơn nhiều so với cùng nồng độ trên nền môi trường đặc. Số chồi đạt 5,25 chồi/mẫu trong thời gian rất ngắn (5 ngày). Các chồi này sinh trưởng rất nhanh, sau 15 ngày đã hình thành các lá thật.

Bảng 4: Kết quả tạo cụm chồi ráy trong môi trường lỏng ở chu kỳ quang

3.4. ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng với sự phát sinh hình thái cây ráy

Trong tự nhiên, ráy là cây ưa ẩm và chịu bóng. Để góp phần tìm hiểu về những đặc điểm sinh thái này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến sự hình thành chồi trên "thân rễ" của chồi mầm trong môi trường lỏng. Kết quả được nêu ở bảng 5:

Bảng 5: ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến sự hình thành cây ráy

Bảng 5 cho thấy trong điều kiện tối hoàn toàn, số lượng chồi ráy được sinh ra trong môi trường lỏng nhiều hơn so với ở điều kiện chiếu sáng 14h sáng/10h tối.

Tóm lại, qua các nghiên cứu thực nghiệm trên, bước đầu chúng tôi rút ra một số nhận xét sau:

- Trên nền môi trường lỏng, cây sinh trưởng nhanh hơn trên nền môi trường đặc.

- Trong điều kiện tối hoàn toàn, số lượng chồi ráy được  sinh  ra  trong  môi  trường lỏng nhiều hơn so với ở điều kiện chiếu sáng14h sáng/10h tối.

Mặc dù ở môi trường lỏng, khả năng tái sinh chồi cao hơn nhưng chồi lại bị mọng nước. Hiện tượng này gây khó khăn cho việc ra cây sau này vì mọng nước làm chồi dễ gãy và khả năng thích nghi với điều kiện bên ngoài yếu. Để tạo điều kiện tốt hơn cho qúa trình đưa cây ra vườn ươm, sau khi chồi được hình thành trong môi trường lỏng, chúng tôi cấy chuyển sang môi trường đặc để tránh hiện tượng mọng nước. Kết quả chồi phát triển đều và xanh (xem ảnh 1).

ảnh 1: Cây ráy sau 1 tuần cấy chuyển từ môi trường        ảnh 2: Cây ráy chuẩn bị đưa vào vườn ươm

lỏng sang môi trường đặc

3.5. Đưa cây ra vườn ươm

Cây ráy in vitro đã đủ điều kiện ra vườn cao từ 10 - 12cm, có 2 - 3 rễ và 3 - 4 lá. Trước khi đưa ra khỏi phòng nuôi cấy, mở nút bình từ 3 - 5 ngày để cây quen với điều kiện tự nhiên, sau đó lấy ra khỏi bình, rửa sạch thạch. Chọn ra 120 cây có kích thước, đặc điểm tương đối đồng đều nhau. Tiến hành thí nghiệm ươm cây trên 4 giá thể: Giá thể 1 là cát, giá thể 2: trấu hun + cát (tỉ lệ 1/1) , giá thể 3: trấu hun + đất (tỷ lệ 1/1), giá thể 4: trấu hun.

Theo dõi tỷ lệ sống của cây sau 60 ngày quan sát ta thu được kết quả sau:

Bảng 6 : Tỷ lệ sống của cây ráy in vitro trên các giá thể ngoài vườn ươm

Có thể nói cây ráy in vitro có khả năng thích nghi tốt với điều kiện môi trường nuôi cấy. Mặc dù cùng điều kiện ngoại cảnh nhưng ở môi trường trấu+ cát, tỷ lệ sống khá cao đạt hơn 90%, trong khi đó ở môi trường trấu và trấu + đất tỷ lệ sống chỉ đạt hơn 50%. Nguyên nhân có thể do độ tơi xốp khác nhau của giá thể cát và cát + trấu hơn giá thể đất. Còn với giá thể chỉ có trấu, mặc dù khả năng tơi xốp cao nhưng khả năng giữ nước lại kém.

4. Kết luận

1. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi ráy trên môi trường đặc MS  +  3mg/1 BAP  đạt trung  bình

3,92 chồi / mẫu nuôi cấy; trên môi trường đặc MS+ 3mg/1 BAP + 0,2 mg/IBA số chồi / mẫu đạt 3,7; trên nền môi trường lỏng MS + 1mg/1 BAP + 0,2 mg/IBA số chồi/mẫu đạt 5,25.

2. Trong điều kiện tối hoàn toàn, số lượng chồi ráy được sinh ra trong môi trường lỏng nhiều hơn so với ở điều kiện chiếu sáng14h sáng/10h tối; số chồi / mẫu cao nhất là ở công thức MS + 1mg/l BAP + 0,2mg/l IBA.

3. ở giai đoạn đưa cây ra vườn ươm, dùng giá thể trấu hun + cát (tỷ lệ 1 : 1), đạt tỷ lệ sống 93,47% là tốt nhất.