Áp dụng kỹ thuật MTT để

đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào lách chuột chịu

stress oxy hoá của các dịch chiết Hà thủ ô, Cúc hoa vàng

Trần Vân Hiền ^(*), Chu Quốc Trường ^(*), Trần Thanh Loan ^(*), Nguyễn Đặng Dũng ^(**). 

^* Bệnh Viện YHCT TW;  ^** Học Viện Quân Y.

(Nhận bài ngày 24  tháng 11 năm 2004) 

Summary

Application of MTT technique in assessment of splenocyte protective effects of the extracts from Polygonum multiflorum andChrysanthemum indicum

Oxidative stress plays a role in pathogenesis of series of diseases, particularly in induction of cell membrane injuries and modification of DNA of lymphocytes, leading to the cell’s loss. In this paper we presented the results obtained from the application of MTT technique in cell culture to assess the antioxidative activities of the extracts from Polygonum multiflorum and Chrysanthemum indicum on cultured murines splenocytes.

Keywords: MTT, hydrogen peroxide, cell culture, splenocytes, extract.

I. Đặt vấn đề

Việc nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của các dược liệu trên mức độ tế bào in vitro mang tính khoa học và xác thực hơn so với các thử nghiệm trong môi trường không tế bào. Theo nhiều tài liệu đã công bố, trong những năm gần đây, các stress oxy hoá đóng góp nhất định vào tình trạng mất tế bào miễn dịch ở nhiều điều kiện bệnh lý như ung thư, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, hoặc bệnh lý người cao tuổi. Để đánh giá chức năng sống của tế bào, kỹ thuật MTT hiện đang được áp dụng phổ biến nhất ở các labo nuôi cấy tế bào thuộc các nước phát triển[1,2,3,4,5]. Kỹ thuật MTT được dựa trên nguyên tắc là MTT [3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid] tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Có thể dùng một số dung dịch khác nhau để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét khả năng áp dụng kỹ thuật MTT để đánh giá tác dụng của một số dịch chiết từ dược liệu đến chức năng sống của tế bào lympho chịu stress oxy hoá.

II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu thực vật: Nguyên liệu nghiên cứu là phần  chiết từ ethyl acetat bay hơi hết dung môi, cắn hoà tan trong PBS, các dịch chiết này đã được xác định là có hoạt tính chống oxy hoá từ hà thủ ô, cúc hoa vàng. Các dịch chiết được chuẩn bị ở nồng độ nhất định và được lọc vô khuẩn qua phễu lọc trước thí nghiệm.

2.2. Hoá chất: Tác nhân gây độc tế bào là H₂O₂. Từ H₂O₂ 30% chuẩn bị dung dịch H₂O₂ 10^-1M.  Sau đó H₂O₂ được pha loãng đến các nồng độ từ 10^-3 đến 10^-6M trong PBS. Lọc vô khuẩn dung dịch H₂O₂ 10^-3M bằng phễu lọc sau đó đã pha loãng tiếp dung dịch này bằng PBS đã vô khuẩn, trong buồng hút vô trùng Laminar. Tất cả các dịch pha loãng này đều được chuẩn bị ngay trước thí nghiệm với tế bào.

MTT: 3- (4,5- dimethylthiazol - 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid] (hãng Sigma), được chuẩn bị ở dung dịch 5mg/ml trong PBS, bảo quản trong lọ bọc giấy bạc và giữ ở 18⁰C.

SDS (Sodium dodecyl sulfat) và DMF (Dimethyl formamid) được pha như sau: Hoà tan 20g SDS trong 100ml dung dịch DMF 50% trong nước cất, điều chỉnh pH của dung dịch đến 4,2.

PBS (Phosphate Buffered Saline tablets, Sigma), 1 viên hoà trong 200ml nước cất sẽ cho một dung dịch PBS 0,01M, pH 7,4.

DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium.

2.3. Phân lập tế bào lympho

Chọn 3 - 5 chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, có trọng lượng 22 ± 1g, do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp. Mổ chuột, lấy lách chuột trong phòng vô khuẩn. Cắt bỏ các tổ chức mỡ nếu có bao quanh lách. Đặt lách chuột vào môi trường DMEM, cắt nhỏ lách thành các mảnh nhỏ khoảng 1^mm3. Sau đó, dùng dụng cụ chuyên dùng để nghiền nhẹ và tách lấy tế bào lách qua mắt rây của dụng cụ đó. Thu hỗn dịch tế bào và đặt trong PBS. Ly tâm rửa tế bào ở 2000v/phút/10phút/4⁰C, 2 lần. Loại bỏ dịch nổi, thêm vào cặn tế bào 1ml PBS và 4ml nước muối đẳng trương. Làm đều huyền dịch. Ly tâm 500vòng/phút trong 5 phút ở 4⁰C, loại bỏ các xơ sợi trong nước nổi. Treo lại tế bào trong 2ml PBS. Đếm tế bào bằng buồng đếm Newbauer. Sau đó, thêm PBS để có nồng độ tế bào là 6 x 10⁶tế bào/ml. (Thường từ 5 chuột có thể thu được 25ml dịch tế bào có nồng độ trên).

Cho vào mỗi giếng nuôi cấy 0,8ml chứa 6 x 10⁶tế bào/ml, lặp lại mỗi 3 giếng cho một loại thử nghiệm. Trong các giếng thử nghiệm, thể tích tổng số là 1ml gồm 0,8ml huyền dịch tế bào, 0,1ml dung dịch H₂O₂và 0,1ml dịch chiết.

2.4. Quy trình thử tác dụng gây độc tế bào bằng H₂O₂ và nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch chiết

a. Xác định các nồng độ gây độc tế bào

Các dung dịch H₂O₂ được chuẩn bị ở các nồng độ giảm dần và đưa vào các giếng nuôi cấy, mỗi giếng 0,2ml để có nồng độ cuối cùng trong các giếng từ 10^-6M đến 10^-3M. Thể tích toàn bộ trong mỗi giếng là lml. Mỗi nồng độ H₂O₂ được lặp lại trong 4 giếng liền nhau.

Sau khi cho H₂O₂ vào môi trường nuôi cấy, đặt phiến nuôi cấy trong tủ ấm nuôi cấy tế bào ở 37⁰C trong môi trường không khí ẩm chứa 5% CO₂, thời gian 1 giờ. Sau đó ly tâm phiến nuôi cấy, 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4⁰C, loại bỏ môi trường. Rửa tế bào 2 lần nữa bằng ly tâm, dùng 1ml PBS cho vào mỗi giếng.

Đặt lại tế bào trong 1ml  PBS. Thêm vào mỗi giếng 100ml MTT 5mg/ml và ủ ở 37⁰C trong 2 giờ. Sau đó loại môi trường có chứa MTT bằng cách dùng pipet, hoà tan cắn tế bào bằng 1ml SDS/DMF, đặt trong tủ 37⁰C/ 10phút, lắc 10 phút, lặp lại 2 lần. Tạo dung dịch đồng nhất bằng cách dùng pipet nhựa, bơm nhẹ dung dịch. Đo độ  hấp thụ của dung dịch trên máy EL_x 800 ở 570nm.

Số lượng tế bào sống tỷ lệ thuận với độ hấp thụ DO.

b. Xác định tác dụng bảo vệ của dịch chiết

Dịch chiết được chuẩn bị để đưa vào các giếng đã có chứa tế bào, không hoặc có chứa H₂O₂ ở các nồng độ khác nhau, bù môi trường vào các giếng để có thể tích dung dịch trong mỗi giếng là 1ml. Nồng độ cuối cùng của dịch chiết trong hỗn hợp tế bào được tính theo 0,1ml dịch chiết đã được chuẩn bị trước. Mỗi giếng thí nghiệm chứa 0,8ml

huyền dịch tế bào, 0,1ml H₂O₂ và 0,1ml dịch chiết.

Các bước tiếp theo được tiến hành như mô tả ở phần (a).

Xử lý kết quả bằng phần mềm tính thống kê Statview 4.5.

III. Kết quả và bàn luận

3.1. Tác dụng gây độc của H₂O₂ đối với tế bào lách nuôi cấy

Bảng 1. ảnh hưởng của nồng độ H₂O₂ đến hoạt độ sống của tế bào lympho từ lách chuột nhắt trắng

Trong điều kiện phản ứng, trong các giếng chứa tế bào lympho lách chuột như nhau, số tế bào sống tỷ lệ với giá trị đo hấp thụ quang học của mẫu ở 570nm và được thấy là giảm đi phụ thuộc vào nồng độ tăng dần của H₂O₂. Khi tăng nồng độ H₂O₂ từ 10^-6M lên đến 10^-3M, số tế bào sống giảm từ 99% xuống còn 40,57%.

Các nồng độ H₂O₂ từ  10^-6M  đến  10^-3M  có thể

được chọn trong các thí nghiệm xác định tác dụng bảo vệ của dịch chiết.

Thí nghiệm đã được lặp lại lần 2, cho kết quả tương tự.

3.2.Tác dụng của dịch chiết hà thủ ô và dịch chiết cúc hoa vàng trong phản ứng gây độc tế bào lách bằng H₂O₂

Bảng 2. Tác dụng bảo vệ của các dịch chiết hà thủ ô và dịch chiết cúc hoa đối với tế bào lách bị gây độc

Bảng 3. Tác dụng bảo vệ của cúc hoa đối với tế bào lách gây độc bằng H₂O₂ từ 10^-6M đến 10^-3M

Bảng 4. Tác dụng bảo vệ của hà thủ ô đối với tế bào lách gây độc bằng H₂O₂ từ 10^-6M đến 10^-3M

Qua các bảng 3, 4,  ta thấy dịch chiết hà thủ ô và cúc hoa ở các điều kiện stress oxy hoá từ 10^-6M đến 10^-3M, H₂O₂ đều làm tăng có ý nghĩa thống kê tỷ lệ tế bào lách còn sống, so với các mẫu không có mặt dịch chiết.

3.3. ảnh hưởng của các dịch chiết đến phản ứng MTT

Các dịch chiết đã nghiên cứu là hà thủ ô  và cúc

hoa đều gây ảnh hưởng trực tiếp đến phép đo quang, nếu không được loại trừ hoàn toàn trước khi cho tế bào phản ứng với MTT. Trên bảng 5, chúng tôi nêu kết quả nghiên cứu khi tế bào lách được ủ với H₂O₂, có mặt các dịch chiết cũng như tế bào lách ủ với dịch chiết trong 1 giờ, sau đó môi trường nuôi cấy được loại đi và việc rửa tế bào chỉ tiến hành 1 lần.

Bảng 5. ảnh hưởng của dịch chiết cúc hoa, hà thủ ô còn lại  trong hỗn hợp tế bào đến phản ứng khử MTT

Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có thể áp dụng kỹ thuật MTT như là một phương tiện đánh giá khách quan tác dụng bảo vệ của dịch chiết thực vật đối với tế bào để hạn chế các tác hại của  môi  trường  nuôi  cấy  tế  bào. Các dịch chiết

thực vật có thể tham gia phản ứng oxy hoá khử với MTT, do đó, cần thận trọng khi lựa chọn các nồng độ nghiên cứu cũng như cần đảm bảo loại trừ sự có mặt dù có mặt ở nồng độ thấp của dịch chiết khi thực hiện phản ứng MTT.